Supervisión de la salud de órganos sólidos después del trasplante usando la DNA sin células

Los diagnósticos basados en cfDNA podían hacer biopsia del tejido obsoleta
Biopsias costosas e invasores del tejido para detectar el rechazo del allograft después del trasplante para tener limitaciones numerosas. Los análisis basados en la DNA sin células (cfDNA) — fragmentos de circulación de la DNA lanzaron de las células, tejidos, y los órganos como experimentan la célula natural muerte-se han estudiado intensivo recientemente y podrían mejorar en última instancia nuestra capacidad de detectar el rechazo, el instrumento cambia anterior en la gestión, e incluso aumenta la supervivencia a largo plazo de órganos trasplantados.
Los análisis de CfDNA que evitan la necesidad del entero-genoma que ordena (WGS) y la necesidad del conocimiento a priori de los genotipos dispensadores de aceite y/o receptores tienen ventajas logísticas potentes y están actualmente bajo escrutinio clínico. Además, la mejora del conocimiento de la cinética órgano-específica del trasplante de siguiente donante-derivado del cfDNA (DD-cfDNA) también ha ayudado a optimizar estos análisis. Los laboratorios también han introducido los métodos alternativos para cuantificar la DD-cfDNA, tal como reacción en cadena digital de polimerasa de la gotita (PCR) y modelos órgano-específicos de la metilación de la DNA. Como tal, el campo de los diagnósticos como mínimo invasores basados sobre cfDNA es cada vez más prometedor, un día potencialmente que substituye biopsias tradicionales del tejido.
EL PAPEL DE CFDNA EN EL RECHAZO DEL ÓRGANO
El rechazo, refiriendo a lesión de un órgano donado causado por el sistema inmune del beneficiario, puede causar la disfunción del allograft e incluso la muerte paciente. El rechazo celular agudo mediado linfocito T (ACR) ocurre lo más a menudo posible en el plazo de los primeros 6 meses de poste-trasplante (1). El ACR implica la acumulación de T-células de CD4+ y de CD8+ en el espacio intersticial del allograft mientras que el sistema inmune del beneficiario reconoce los antígenos en el órgano donado como extranjero. Estas T-células inician una cascada inmune que lleve en última instancia a la muerte celular programada (apoptosis) de las células apuntadas. Mientras que mueren estas células, se hiende la DNA genomic y los fragmentos de la DD-cfDNA, midiendo aproximadamente 140 pares bajos (bp) de largo, se lanzan para unirse a la piscina del cfDNA receptor en la sangre y se excretan en última instancia en la orina (2).
El cfDNA de circulación leveraged recientemente como una herramienta de diagnóstico para substituir biopsias invasores en otras áreas de la medicina, incluyendo analizar fragmentos fetales de la DNA dentro de la circulación maternal para identificar anormalidades genéticas in utero y la secuencia de la DNA de circulación lanzada de las células del tumor para identificar mutaciones cáncer-relacionadas. En ambos estos casos así como en el trasplante, la secuencia de la alto-producción que identifica y cuantifica diferencias de las secuencias de ADN distingue entre las dos diversas poblaciones de cfDNA derivadas de fuentes distintas (2). Tres características del cfDNA le hacen un biomarker no invasor excelente del candidato para detectar el rechazo después del trasplante sólido del órgano: Puede ser obtenido de un drenaje simple de la sangre, de su concentración medida exactamente, y de su secuencia de nucleótido identificada fácilmente. Usando cfDNA como biomarker para el ACR es también ventajoso puesto que se deriva de las células heridas del órgano donado y por lo tanto debe representar una medida directa de la muerte celular que ocurre en el allograft. Además, el cfDNA mantiene todas las características genéticas de la DNA genomic original, permitiendo el material genético lanzado del órgano donado que se distinguirá del cfDNA derivado de las células del beneficiario que están experimentando el apoptosis natural (3).
La supervisión frecuente y exacta de la salud del allograft es esencial para la supervivencia a largo plazo de los beneficiarios del trasplante. Para el trasplante (HT) del corazón, la biopsia endomyocardial (EMB) es el patrón oro actual para detectar al ACR (4). Sin embargo, EMBs es costoso con las limitaciones significativas, muchas cuyo sea común a todas las biopsias del órgano (5-7). Por otra parte, la naturaleza invasor de EMBs pone a pacientes del HT en riesgo de las complicaciones (6,8,9).
Desafortunadamente, métodos no invasores actualmente disponibles incluyendo la ecocardiografía o especificidad de la proyección de imagen de la falta de resonancia magnética de (MRI) la suficiente y sensibilidad para detectar confiablemente el rechazo (10-13). los biomarkers Sangre-basados, tales como cfDNA, representan una alternativa prometedora que se podría ejecutar fácilmente en la práctica clínica (14-17).
CINÉTICA DE CFDNA DURANTE QUIETUD Y EL RECHAZO
Puesto que el cfDNA origina del proceso natural del apoptosis, todos los individuos tienen niveles perceptibles de cfDNA en su sangre (18). Para los individuos sanos, la mayoría de cfDNA de circulación viene de las células hematopoyéticas que han experimentado la muerte natural relacionada con el volumen de ventas celular. Los niveles de cfDNA fluctúan por razones múltiples incluyendo la infección, la cirugía, el trauma, o aún el ejercicio exhaustivo (2,19). Por lo tanto, desarrollar un análisis cfDNA-basado para detectar el rechazo requiere la determinación de la cinética prevista del lanzamiento DD-cfDNA en el poste-trasplante de la circulación del beneficiario. Esta consideración es especialmente importante puesto que la liberación del poste-trasplante DD-cfDNA es en un cierto plazo órgano-específica (20-22).
Por ejemplo, en 1 poste-HT del día el nivel medio de DD-cfDNA es 3,8 el ± 2,3% (20). Sin embargo, por 7 días el nivel de DD-cfDNA ha disminuido rápidamente y sigue siendo constantemente bajo (<1> en cambio, encontraron a los beneficiarios de los trasplantes bilaterales del pulmón para tener una fracción media DD-cfDNA 26 del ± el 14% en el primer día postoperatorio. Además, seguida habiendo la reducción en la DD-cfDNA fue caracterizada por los niveles de DD-cfDNA que disminuyeron rápidamente dentro de la primera semana pero por otra parte reducida y generalmente en 1%-3% (21). Sin embargo, similar a los trasplantes del corazón y del riñón durante un episodio del rechazo agudo, el nivel de DD-cfDNA aumentó perceptiblemente, subiendo a una media de 14%-15%.
Las diferencias en masa de tejido y índices de volumen de ventas celular explican esta variabilidad en los niveles de poste-trasplante temprano lanzado DD-cfDNA y durante quietud. Por ejemplo, las diferencias en la circulación de los niveles DD-cfDNA en trasplantes bilaterales y del solo-pulmón quietos se pueden explicar por la diferencia en volumen de ventas celular, siendo 107 contra 58 células/en segundo lugar, respectivamente (21). Por el contrario, en un corazón trasplantado quieto, la tarifa de volumen de ventas celular es solamente 8 células/en segundo lugar (21-23). Así, una comprensión de los niveles previstos de DD-cfDNA asociados a un órgano sólido dado es esencial facilitar el desarrollo de los análisis órgano-específicos que detectan el rechazo. Una vez que la cinética de la liberación del cfDNA para un órgano particular se entiende, varios métodos existen para cuantificar la cantidad relativa de DD-cfDNA.
ESTRATEGIAS PARA DISTINGUIR AL BENEFICIARIO CONTRA DONOR-DERIVED CFDNA
Sexo-unión mal hecha del Donante-beneficiario
Para los trasplantes de órgano en los cuales el donante es masculino y el beneficiario es femenino, los laboratorios pueden leverage esta unión mal hecha del sexo para calcular los niveles DD-cfDNA dentro de la piscina total del cfDNA del beneficiario (17). Los investigadores primero demostraron la viabilidad de este acercamiento en las muestras de orina recogidas de los beneficiarios renales femeninos del trasplante que habían recibido un riñón de los donantes masculinos y cuando experimentaron niveles elevados demostrados rechazo de DD-cfDNA en su orina que contuvo específicamente las regiones encontradas en el cromosoma de Y (17). Aunque este acercamiento permita la diagnosis confiada del rechazo en el allograft, la sexo-unión mal hecha entre el donante y el beneficiario es relativamente infrecuente y no no universal aplicable.
Diferencias de las secuencias de ADN del Donante-beneficiario
Un trasplante de órgano se puede también mirar como trasplante del genoma, pues las células dentro de un órgano trasplantado contienen la información genética de su donante. Como tal, el concepto de dinámica (GTD) del trasplante del genoma confía en la presencia de diferencias genéticas entre el donante y el beneficiario en un lugar geométrico particular, que entonces se puede leveraged para identificar el origen del cfDNA de circulación (20-24). Idealmente, el beneficiario sería homocigótico para una sola base (por ejemplo, AA) y en el mismo lugar geométrico el donante sería homocigótico para una diversa base (por ejemplo, GG).
Dado la heterogeneidad genética entre los individuos, decenas de miles de lugares geométricos potencialmente informativos a través del genoma se pueden interrogar usando la alto-producción que ordena para distinguir la DD-cfDNA del cfDNA receptor (20,24). Este concepto primero fue ilustrado usando muestras depositadas de donantes cardiacos para obtener los genotipos dispensadores de aceite as priori para cada apareamiento del donante-beneficiario. Después de extraer y de ordenar el cfDNA de cada beneficiario, la fracción de moléculas donante-específicas era resuelta. En las muestras recogidas durante o inmediatamente antes de un acontecimiento biopsia-probado del rechazo, la proporción de solos polimorfismos donante-específicos (SNPs) del nucleótido fue encontrada para haber aumentado a partir <1>de la 3%-4% (24).
Este estudio retrospectivo temprano ahora se ha validado anticipado. Reclutaron a los beneficiarios adultos y pediátricos del trasplante del corazón y del pulmón y los genotipos para cada par del donante-beneficiario fueron obtenidos a través del WGS con una media de 53.423 marcadores informativos de SNP identificados (20). La detección total, temprana de rechazo agudo era superior a la de AlloMap, la primera comida y droga acercamiento no invasor Administración-aprobado a detectar al ACR después del HT basado en el análisis del transcriptome (25).
La investigación también ha mostrado que el WGS no sólo proporciona la información sobre un injerto pero también el virome de un paciente y el estado total de la immunosupresión. Esto representa una ventaja potencialmente grande inalcanzable por otros análisis (26-28).
Sin embargo, el WGS hace frente a los desafíos que podrían evitar que sea ejecutado rutinario en práctica clínica. Por ejemplo, mientras que la información genética de un beneficiario puede ser obtenida fácilmente, esto no es siempre verdad para un donante. Por otra parte, el WGS es costoso, necesitando mucho trabajo, y largo.
Un método alternativo emplea un panel de SNPs polimórfico genotyped identificado dentro de la piscina del cfDNA extraído de tal modo que elimina la necesidad del conocimiento a priori del genotipo específico de un donante (29). A diferencia de los trasplantes del riñón y del hígado, que ocurren a menudo entre los individuos estrechamente vinculados, los pares del donante-beneficiario para el corazón y los trasplantes del pulmón no son típicamente relacionados. GTD requiere genotyping del beneficiario y del donante del trasplante. Sin embargo, la información dispensadora de aceite del genotipo es en la práctica a menudo inasequible. Aquí, abordamos este problema desarrollando un algoritmo que estime los niveles DD-cfDNA en ausencia de un genotipo dispensador de aceite. Nuestro algoritmo predice el rechazo del allograft del corazón y del pulmón con una exactitud que sea similar a GTD convencional. Además refinamos el algoritmo para manejar los beneficiarios y los donantes estrechamente vinculados, un escenario que es común en médula y el trasplante de riñón. Mostramos que es posible estimar la DD-cfDNA en los pacientes trasplantados de la médula que están sin relación o que son hermanos de los donantes, usando un modelo de Markov ocultado. Por lo tanto, los algoritmos se han desarrollado para los trasplantes del corazón y del pulmón que asumen que el genotipo del donante ocurre en la misma frecuencia que la población en general. De acuerdo con estas frecuencias y la comparación al genotipo sabido del beneficiario, la fracción de la DD-cfDNA se puede estimar confiablemente de la piscina total del cfDNA aislada de la muestra del plasma de un beneficiario.
En el caso del trasplante del pulmón, este modelo del solo-genoma, cuando estaba comparado a la metodología usando los genotipos dispensadores de aceite y receptores, fue encontrado para proporcionar fracciones comparables de la DD-cfDNA. Sin embargo, cuando los investigadores aplicaron este mismo algoritmo al HT, los niveles estimados de DD-cfDNA no fueron correlacionados tan fuertemente como en trasplantes del pulmón. Esto se pudo relacionar con las cantidades absolutas más bajas de DD-cfDNA presentes después del HT. Éste es otro ejemplo de la cinética órgano-específica del cfDNA que puede influenciar resultados del análisis y debe ser tenida en cuenta (30).
En el caso del trasplante renal, los estudios anticipados se han conducido para comprobar la utilidad de los niveles DD-cfDNA, identificada usando SNPs donante-específico conocido, como marcador viable para el rechazo. En un tal estudio, reclutaron a 384 beneficiarios del riñón a partir de 14 sitios clínicos para proporcionar muestras de sangre en los intervalos programados y en tiempos de las biopsias clínico indicadas (31). Total, el estudio se centró en la correlación entre la histología en 107 especímenes de la biopsia a partir de 102 pacientes y los niveles de DD-cfDNA encontrados en muestras hechas juego del plasma. Más concretamente, 27 muestras de la biopsia a partir de 27 pacientes con el rechazo activo fueron obtenidas junto con 80 muestras de la biopsia a partir de 75 pacientes sin el rechazo activo.
En este estudio, el rechazo activo incluyó el rechazo anticuerpo-mediado agudo (AMR), Amr crónico, y ACR. El análisis usado en este estudio empleó un atajo del 1% para la fracción de la DD-cfDNA para indicar la presencia o la ausencia de rechazo activo y fue encontrado para tener la especificidad del 85% (ci del 95%, 79%-91%) y sensibilidad del 59% (ci del 95%, 44%-74%). La sensibilidad de este análisis era mayor para discriminar entre el Amr activo y ausente, pues el uso de un atajo de la DD-cfDNA del 1% fue encontrado para tener una especificidad del 83% (ci del 95%, 78%-89%) y sensibilidad del 81% (ci del 95%, 67%-100%). Notablemente, en ambos casos, la sensibilidad disminuyó substancialmente cuando la fracción de la DD-cfDNA excedió del 3%.
Para mejorar especificidad y sensibilidad de un análisis cfDNA-basado no invasor para detectar el rechazo el seguir del trasplante renal, los investigadores también han examinado la cantidad absoluta de DD-cfDNA (32-33). Interrogando a la cantidad absoluta de DD-cfDNA, una puede eliminar los cambios artificiales en la fracción de la DD-cfDNA debido a los aumentos en los niveles totales del cfDNA causados por acontecimientos del no-rechazo, tales como infección, trauma, o ejercicio, potencialmente creando un análisis más exacto.
Para investigar esta posibilidad, un estudio empleó 32 variantes informativas (CNVs) del número de copia basado en frecuencias de la población, en comparación con proporciones relativas de dispensador de aceite y de beneficiario SNPs en los lugares geométricos dados (32). Todo el CNVs no presente dentro del genoma de un beneficiario pero el presente dentro del cfDNA extraído por lo tanto fue asumido para representar la DD-cfDNA.
Interesante, mientras que la especificidad y la sensibilidad mejoraron en conjunto con el uso de los niveles absolutos DD-cfDNA, este análisis también tenía una mayor capacidad de distinguir entre la presencia y la ausencia de Amr activo, en comparación con casos del ACR activo. Además, los niveles de la creatinina del suero no eran suficientes en la discriminación entre el rechazo activo y la quietud, probables porque es más indicativa de la función glomerular en comparación con el daño tisular del riñón (31-33).
Otro estudio exploró los niveles absolutos de DD-cfDNA en los beneficiarios del trasplante del riñón relacionados con los niveles de tacrolimus, un inmunosupresor (33). Aquí, los investigadores encontraron que la cantidad absoluta de DD-cfDNA era substancialmente más alta en pacientes con un tacrolimus más bajo nivela (<8> los laboratorios también han propuesto alternativas al WGS. Nuestra secuencia apuntada explorada grupo de 124 (frecuencia de menor importancia del alelo [MAF] >0.4) SNPs altamente polimórfico usando un panel disponible en el comercio, la siguiente generación que ordena, y un algoritmo nuevo (34). Este acercamiento redujo perceptiblemente el periodo total de ordenar costes y tiempo requerido, de disminución del análisis, y la permisión de análisis rápido. Sin embargo, puesto que este análisis confía en diferencias en MAF entre los individuos, no sería robusto para los pares estrechamente vinculados del donante-beneficiario, tales como visto en la donación vivir-relacionada del riñón. Queda validar para detectar acontecimientos moderados o mayores del rechazo.
Los laboratorios también han explorado usando SNPs polimórfico para cuantificar la DD-cfDNA combinada con la tecnología de la polimerización en cadena digital de la gotita (30,35-37). Usando 41 SNPs altamente polimórfico, el riñón estable y los beneficiarios del HT mostraron las fracciones DD-cfDNA de 2%-3% con los beneficiarios estables del trasplante del hígado que tenían un nivel del 7% (35).
CONCLUSIONES
El uso de una biopsia costosa e invasor del tejido de detectar el rechazo del allograft tiene limitaciones significativas. Como tal, un análisis como mínimo invasor que puede evaluar directamente y exactamente la salud del órgano trasplantado entero representa un santo grial en el trasplante sólido del órgano.
El uso del cfDNA después de que el trasplante haya mostrado una cierta promesa inicial, pero estudia más lejos y la validación se requiere para mejorar nuestra comprensión de la biología básica del cfDNA así como de su poste-trasplante del comportamiento. En este tiempo, está claro que existen las diferencias órgano-específicas importantes, y los modelos del lanzamiento del cfDNA pueden también diferenciar dependiendo del tipo de acontecimiento del rechazo. Sin embargo, el cfDNA representa uno de las tecnologías más prometedoras con todo desarrollado para complementar o aún para substituir en última instancia la biopsia del tejido.